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知识点总结
该知识点包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定等几个要点知识。
1. 目的基因的获取：目的基因是指编码蛋白质的结构基因。原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。直接分离目的基因的方法有：①从基因组文库中获取：即用限制酶进行切割、分离；②从cDNA文库中获取：即利用mRNA反转录形成；③利用PCR扩增技术：获取大量目的基因。人工化学合成适用于分子较小的基因。
2. 基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤。
目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在、能够表达和发挥作用，并且可以遗传至下一代。
组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因。
启动子：是一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。
终止子：也是一段特殊结构的DNA片段 ，位于基因的尾端。
标记基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素抗性基因。
3. 将目的基因导入受体细胞：（以下知识要点是同学们必须要掌握的）
转化：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
常用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采用最多的方法是 农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是 显微注射技术。此方法的受体细胞多是受精卵。将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少 ，最常用的原核细胞是大肠杆菌 ，其转化方法是：先用 Ca2+ 处理细胞，使其成为感受态细胞 ，再将重组表达载体DNA分子 溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。重组质粒导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。
4.目的基因的检测与鉴定：（1）首先要检测 转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA分子杂交技术。（2）其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用用标记的目的基因作探针与mRNA杂交。（3）最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原－抗体杂交。（4）有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。
常见考法
在平常测试中，该知识点有较大比例，多以选择题或简答题的形式出现。通常考查基因工程基本操作步骤及相关步骤的实施方法、要点及涉及的酶等多方面的的知识，出题形式多以基因工程模式图为背景切入，难度中等。在高考中，从近几年生物试题看，本部分知识一直是高考命题的热点，题目多以简答题形式考查。以新科技材料及图解为背景切入，考查的知识点比较基础。所以同学们要认真记忆上述基础知识。
误区提醒
本部分易错问题主要集中在：获取目的基因的方法、基因表达载体的结构、目的基因导入细胞的方法及目的基因鉴定与检测的方法。同学们在复习时一定要关注以下易错点：
（1）目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。
（2）基因工程操作过程中只有第三步（将目的基因导入受体细胞）没有碱基互补配对现象。第一步逆转录法获得DNA，第二步黏性末端连接，第四步检测分子水平杂交方法。
（3）原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
（4）一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。
（5）目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。
（6）不熟悉标记基因的种类和作用：标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因（表达产物为带颜色的物质）等。
（7）对受体细胞模糊不清：受体细胞常用植物受精卵或体细胞（经组织培养）、动物受精卵（一般不用体细胞）、微生物（大肠杆菌、酵母菌）等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌（需内质网、高尔基体的加工、分泌）；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。
（8）还应注意的问题有：①基因表达载体中，启动子（DNA片段）≠起始密码子（RNA）；终止子（DNA片段）≠终止密码子（RNA）。②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。
【典型例题】
浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因（如P450基因和红霉素抗性基因）的表达和酶活性都得到提高，在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答下列问题：
（1）获得油菜素内酯合成酶基因的方法有____________________________________。步骤①用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指____________________________；步骤②用到的酶有_______________________________________________________________。
（2）图中导入重组质粒的方法是_________，在导入之前应用一定浓度的______________处理受体细菌。
（3）导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用____________________制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入________________可将含有目的基因的细胞筛选出来。
（4）请你为该课题命名：____________________________________________________。
答案：（1）从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增技术（任选其中两项即可） TaqDNA聚合酶 限制酶和DNA连接酶 （2）转化法 氯化钙溶液 （3）红霉素抗性基因 红霉素（4）探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解
解析：进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增技术等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故用转化法导入基因表达载体，导入后，需检验和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。
