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知识点总结
该知识点包括凝胶色谱法、缓冲溶液、电泳、实验操作及操作提示等几个要点知识。
1. 凝胶色谱法：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有效方法。凝胶实际上是一些由多糖类化合物构成的多孔球体，在小球体内部有许多贯穿的通道，相对分子质量不同的蛋白质分子通过凝胶时速度不同，相对分子质量较小的蛋白质比较容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；而相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。
2. 缓冲溶液：缓冲溶液的作用是能够抵制外界的酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。缓冲溶液通常由1-2种缓冲溶剂溶解于水中配制而成的。生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，例如：血浆的pH是7.35～7.45，要在实验条件下准确模拟生物体内的过程，必须保持体外的pH与体内的基本一致。
3.电泳：电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程。许多重要的生物大分子，如蛋白质、核酸等都具有可解离的基团，在一定的pH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。
两种常用的电泳方法是琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳，在测定蛋白质分子量时通常使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速率取决于蛋白质所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。
4. 实验操作及操作提示：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。
血红蛋白的提取和分离过程中应注意：
（1）红细胞洗涤过程中，洗涤三次后，如上清液仍有黄色，可增加洗涤次数，否则无法除去血浆蛋白；离心时转速要低，时间要短，否则白细胞等会一同沉淀，达不到分离效果。
（2）血红蛋白释放过程中，蒸馏水的作用是涨破红细胞，甲苯作用主要是溶解细胞膜。
（3）为了加快干凝胶的膨胀，可将加入洗脱液的湿凝胶用沸水浴加热，通常只需1～2 h，还可除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。
（4）在色谱柱中填凝胶的时候要尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。在装填凝胶柱时，不得有气泡存在，因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。在凝胶色谱操作过程中，不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。一旦发生上述两种情况，凝胶色谱柱需要重新装填。
（5）滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，不要破坏凝胶面。
（6）根据红色区带的移动状况判断收集流出液时间。
常见考法
在平常测试中，该知识点多以选择题或填空题的形式出现。通常考查蛋白质的提取方法、原理、实验操作等基础知识。出题形式灵活，难度中等。从近3年高考生物试题看，只是在2013年的四川卷中有一个空涉及到了凝胶色谱法。今年可能会考查这个知识点，一定要夯实基础知识。
误区提醒
提取蛋白质的方法易混淆，对血红蛋白提取步骤及相关注意事项掌握不牢也是做错题的原因之一。因此，要突破本专题：首先，要掌握血红蛋白的提取原理：蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等，可以用来分离不同种类的蛋白质。其次，要掌握相关方法：凝胶色谱法和电泳法（常用的电泳法有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳）。最后，要掌握血红蛋白的提取和分离步骤及相关注意事项。
【典型例题】红细胞中含有大量的血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是 （ ）
A．血红蛋白提取和分离一般按照样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定的顺序进行
B．纯化过程中要用生理盐水充分溶胀凝胶来配制凝胶悬浮液
C．粗分离中透析的目的是去除相对分子质量较小的杂质
D．可经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定
答案：B
解析：蛋白质的提取和分离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。提取和分离血红蛋白时，首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即样品处理；再通过透析法除去相对分子质量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂蛋白除去，即样品纯化，纯化过程中凝胶应用蒸馏水充分溶胀后，配制成凝胶悬浮液，而不是用生理盐水；最后经SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。
